METODOLOGÍAS ANALÍTICAS PARA LA DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDOS GRASOS Y AMINOÁCIDOS DURANTE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DEL VINO: APLICACIÓN DE LAS ESPECTROSCOPIAS IR-TF Y RMN EN COMBINACIÓN CON MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS

Abstract

La fermentación alcohólica del vino es un proceso anaeróbico altamente complejo por su gran número de compuestos y reacciones bioquímicas involucradas. Debido a los múltiples factores que influyen en el transcurso de la fermentación, existe una gran variabilidad en el contenido de α-aminoácidos, ácidos grasos de cadena media (MCFA) y ácidos grasos de cadena larga insaturados (LCUFA). Por esta razón, es deseable conocer las concentraciones de estas sustancias ya que pueden ser variables críticas que no son consideradas durante el monitoreo de la fermentación. El contenido de ácidos grasos y α-aminoácidos no se determinan rutinariamente debido a que la cuantificación es realizada por cromatografía gaseosa (GC) y cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) respectivamente, involucrando tratamientos de muestra muy largos, análisis costosos y poco amigables con el medio ambiente. De aquí, nace la necesidad de desarrollar métodos alternativos eficientes y confiables que permitan conocer el contenido de estas sustancias. En la presente tesis se desarrollaron dos nuevas metodologías analíticas para la cuantificación de diversos componentes en la fermentación alcohólica del vino de la cepa Carménère. Para ello se emplearon distintas técnicas cromatográficas y espectroscópicas, con el objetivo de cuantificar MCFA, LCUFA y aminoácidos. Se desarrolló y validó la metodología analítica por GC-FID, para la identificación y cuantificación del contenido de MCFA como C6:0 (~ 0,61-47,55 mg/L), C8:0 (~ 0,56-87,59 mg/L), C10:0 (~ 0,39-84,73 mg/L), C12:0 (~ 0,32-8,75 mg/L) y LCUFA como C14:1 (~ 0,54- 9,91 mg/L), C16:1 (~ 0,51-45,78 mg/L), C18:1 (~ 0,44-26,96 mg/L), C18:2 (~ 0,50-62,17 mg/L), C18:3 (~ 0,46-25,24 mg/L) en mostos de fermentaciones normales y problemáticas. La determinación de estos compuestos en mostos en fermentación involucró dos pasos: la preparación de los metil ésteres de ácidos grasos por derivatización con BF3 y el análisis por GC-FID. Para algunos analitos, se encontraron por debajo de los límites de cuantificación del método. Por otro parte, se pudo identificar los MCFA y LCUFA mediante espectroscopia IR-TF en el rango medio (MIR) para mosto sintético y mosto real que incluye fermentaciones normales y problemáticas. Se evaluó dos formas de toma de muestra (seca y húmeda), las cuales no tuvieron diferencia en la información espectral entregada. Se desarrollaron los modelos de calibración y validación con la herramienta quimiométrica PLS, basados en determinaciones por IR-TF y GC-FID. Se aplicaron diferentes pretratamientos espectrales, que permitieron corregir efectos indeseados en los espectros. Los modelos desarrollados con mosto sintético en su forma húmeda y seca cumplieron los criterios de aceptación logrando una buena capacidad predictiva, con RMSEP (<12%) y R2 por encima de 0,990; mientras que, en muestras reales los modelos no fueron aceptables debido a la alta variabilidad en los valores de referencia. Se logró implementar y validar la metodología analítica por HPLC, en la modalidad de fase reversa y detección directa al UV a 280 nm, para la identificación y cuantificación de α-aminoácidos como ácido L-glutámico (~64,5-473,6 mg/L), L-arginina (~9,9-115,4 mg/L), DL-alanina (~3,7-104,9 mg/L), L-glutamina (~7,2-125,2 mg/L) en mostos de fermentaciones normales. No se pudo cuantificar la L-prolina. Se requirió un tratamiento previo de la muestra, derivatización con EMMDE. Se identificaron los α-aminoácidos (Ac. L-glutámico, L-arginina, DL-alanina, Lglutamina y L-prolina) mediante espectroscopia RMN de alta resolución de estándares de referencia, y se verificó la presencia de alanina y prolina en mostos de fermentaciones normales con la aplicación de la técnica TOCSY. Se desarrollaron modelos de calibración y validación con PLS, basados en determinaciones por RMN y HPLC-UV en mosto de fermentaciones normales. Los aminoácidos tuvieron errores de predicción muy por encima de lo esperado, excepto para la glutamina que tuvo RMSEP de 18,7% y R2 de 0,305.The alcoholic fermentation of wine is a highly complex anaerobic process due to its large number of compounds and biochemical reactions involved. Due to the multiple factors that influence the course of the fermentation, there is a great variability in the content of α-amino acids, medium chain fatty acids (MCFA) and long chain unsaturated fatty acids (LCUFA). For this reason, it is desirable to know the concentrations of these substances since they can be critical variables that are not considered during the monitoring of the fermentation. The content of fatty acids and α-amino acids are not determined routinely because the quantification are performed by gas chromatography (GC) and high efficiency liquid chromatography (HPLC) respectively, involving very long sample treatments, costly and unfriendly analyzes with environment. Hence, the need arises to develop efficient and reliable alternative methods that allow knowing the content of these substances. In this thesis, two new analytical methodologies for quantification of several components of Carménère wine alcoholic fermentation were developed and evaluated. Specifically, for determination of MCFA, LCUFA and amino acids, chromatographic and spectroscopic techniques were used. Analytical methodology by GC-FID was implemented and validated for identification and quantification of MCFA content as C6:0 (~ 0,61-47,55 mg/L), C8:0 (~ 0,56-87,59 mg/L), C10:0 (~ 0,39-84,73 mg/L), C12:0 (~ 0,32-8,75 mg/L) and LCUFA as C14:1 (~ 0,54-9,91 mg/L), C16:1 (~ 0,51-45,78 mg/L), C18:1 (~ 0,44-26,96 mg/L), C18:2 (~ 0,50-62,17 mg/L), C18:3 (~ 0,46-25,24 mg/L) in musts of normal and problematic fermentations. Determination of these compounds in fermentation involved two steps: preparation of methyl ester of fatty acids (FAMEs) by derivatization with BF3, and the analysis by GCFID. Some analytes were below the limits of method quantification. Additionally, unsaturated medium chain and long chain fatty acids were identified by FTIR spectroscopy in the middle range (MIR), for normal and problem fermentations and with artificial and real must. Dry and wet sampling were tested, none differences in the spectral information were found. Using the FTIR and GC-FID measurements, calibration and validation models with PLS chemometric tool were developed. Different spectral pre-treatments were applied, which allowed to correct undesired effects in the spectra. All the models for artificial must (wet and dry) reached the acceptance criteria with good predictive capacity, RMSEP <12% and R2 above 0,990, while in real must the models were not acceptable due to the great variability in the reference values. Analytical methodology by HPLC in reverse phase modality and direct UV detection at 280 nm, was implemented and validated for identification and quantification of α-amino acids L-glutamic acid (~ 64,5-473,6 mg/L), L-arginine (~ 9,9-115,4 mg/L), DL-alanine (~ 3,7-104,9 mg/L), L-glutamine (~ 7,2-125,2 mg/L) in musts of normal fermentations. The L-proline could not be quantified. A sample pre-treatment and derivatization with EMMDE were required. The α-amino acids (L-glutamic acid, L-arginine, DL-alanine, L-glutamine and L-proline) were identified by high resolution NMR spectroscopy of reference standards. Alanine and proline in normal fermentation musts were detected with the application of TOCSY technique. Using the NMR and HPLC-UV measurements in normal fermentations, calibration and validation models with PLS were developed. Prediction errors were higher than expected, except for glutamine with RMSEP of 18,7% and R2 of 0,305.