EVALUACIÓPN DE DISEÑOS EXPERIMENTALES PARA LA DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS

Abstract

Se utilizó la metodología de superficie de respuesta para la predicción de parámetros cinéticos de la reacción de hidrólisis enzimática de músculo de salmón (Salmo salar) utilizando la proteasa comercial Alcalasa 2.4L. Se comparó la máxima varianza de la predicción ajustando polinomios de segundo orden con diseos G-Óptimos y clásicos de tres factores y tres niveles. Se midió la velocidad inicial de la reacción para la determinación de los parámetros cinéticos de Michaelis-Menten variando los factores recíproco de concentración de sustrato (1?10 [1/%]), temperatura (30?60 [?C]) y pH (8-10). Se obtuvo la curva de hidrólisis en 2 horas de reacción para la determinación de los parámetros cinéticos a y b del grado de hidrólisis a partir de ajuste de regresión no lineal, variando los factores concentración de enzima (0.25-1.75 [?l/gmezcla]), concentración de sustrato (1.5-7.5 [%]) y temperatura (40-60 [?C]). Los parámetros cinéticos de Michaelis-Menten son afectados solamente por la temperatura y la vmáx guarda relación lineal con este factor, alcanzando vmáx predicciones entre 0,113 y 0,965 [?mol/ml?min] y Km entre 0,007 y 0,159 [%]. Por otro lado, los parámetros cinéticos del grado de hidrólisis se ven afectados por todos los factores en estudio, con excepción de la concentración de enzima sobre el parámetro b. El parámetro a aumenta con la concentración de enzima y con la temperatura, y disminuye con la concentración de sustrato, alcanzando valores de predicción entre 0,001 y 0,159 [%DH/s]; por su parte, el parámetro b presenta un mínimo global de 0,150 [1/%DH] a 50 [?C] y 6 % de concentración de sustrato, un punto silla a la misma temperatura con una concentración de sustrato cercana a 2,75 % y dos máximos a máxima concentración de sustrato (7,5 %) y temperaturas extremas (40 y 60 [?C]). Se propone un nuevo criterio de optimización de diseos exactos que minimiza la máxima varianza de la predicción en toda la región de estudio, un criterio de estabilidad de la varianza de la predicción y un método de reducción de modelos. Se concluyó que los modelos ajustados por diseos clásicos entregan menor máxima varianza de la predicción que los ajustados por diseos diseos clásicos. Sin embargo, los modelos reducidos generados a partir de diseos G-Óptimos o clásicos son iguales de buenos para ajustar superficies de respuesta respecto a máxima varianza de la predicción y R2ajustada.